美国红枫种胚愈伤组织诱导、增殖培养的研究

随着我国城市环境建设由单纯的绿化逐渐向绿化、美化、彩化方向发展,很多企业从国外大量引种彩叶树,但存在引种成本高、一些品种发芽率低、种子繁殖易发生变异、常规繁殖周期长和繁殖系数低、苗木量短期难以满足市场需求的问题。

针对上述问题,我们以美国红枫种胚为接种材料,进行种胚愈伤组织诱导、增殖培养的研究,为进一步开展包括美国红枫在内的彩叶树组培快繁提供理论依据。

一、材料和方法

（一）、材料：美国红枫种子,市售。

（二）、方法

1、种子处理与接种：美国红枫种子水浸24h后,在超净台上于70%的酒精液中浸泡30s,然后放入0.1%升汞液中浸泡10min,最后用无菌水冲洗4次,以无菌滤纸吸干种子表面水分,剥去种皮,将种胚分别接种于诱导培养基上,每瓶接种胚1个。

2、诱导培养：愈伤组织诱导培养基。培养基分别附加0.8%琼脂和1.5%的葡萄糖,培养室温度为25℃,光照为1500~2000lx。2周后调查愈伤组织诱导情况。

3、增殖培养：将愈伤组织切成0.5cm2小块,转接至增殖培养基,每瓶接1块愈伤组织。培养基分别附加0.8%琼脂和1.5%的葡萄糖,培养室温度为25℃,光照为1500~2000lx。分别于25d和15d调查两次增殖培养时不同培养基对愈伤组织增殖的影响。

二、结果与分析

（一）、不同培养基对愈伤组织诱导的影响

种胚接种1周后,2号和3号种胚子叶有发褐迹象,无愈伤组织产生,3号种胚膨大;1号和4号培养基诱导效果较好,4号中种胚的子叶表面逐渐膨大,向上卷起,边缘有粉红色突起。2周后,4号愈伤组织变大,由粉红色转为黄绿色且向中间扩展,并逐渐长大,约2cm2左右,质地较致密,而1号虽出现愈伤组织,但后期质地较硬,突起少,棕红色;3号种胚发育成无菌幼苗;2号种胚变褐死掉。相对而言,4号培养基比较适合诱导愈伤组织。另外,从2号与4号的培养基成分来看,由于选用MS基本培养基的剂量不同,培养效果则呈现明显差异,说明培养基中无机盐含量低有利于愈伤组织诱导。这与胞外环境渗透压大小影响细胞分裂有关。

（二）、不同培养基对愈伤组织增殖的影响

初代诱导出的愈伤组织在培养一个月后,转接到增殖培养基。综合比较诱导率与增殖系数二项指标,5号增殖效果好于1号和6号,而且从跟踪调查结果来看,5号愈伤组织短时间内诱导、增殖快,质地致密疏松程度,利于下一步的芽分化。这说明5号培养基附加的BA和较高浓度的NAA,以及二者的添加比例更适合美国红枫愈伤组织的诱导和增殖。另外,培养基中附加GA的作用效果不明显是否与浓度低有关,需进一步试验验证。

从第二次增殖培养结果可以看出,仍然是5号培养基愈伤组织诱导率高。转接半个月后,5号培养基中的愈伤组织就形成粉红色突起,随着培养时间延长,粉红色突起逐渐变成紫红色和浅绿色,并不断扩大,最大的约有0.5cm2左右,7和8号中的愈伤组织诱导情况较差,有50%以上的愈伤组织生长慢、停止生长或死亡,所形成的愈伤组织也较5号中的小得多。从培养基成分分析得知,愈伤组织诱导、增殖培养基必须同时添加一定量的细胞分裂素和细胞生长素,而且不必添加GA。

另外,将5号增殖培养2个月、已老化的愈伤组织再次转接到5号新鲜培养基上,半个月后的愈伤组织生产情况见表4。从愈伤组织的生长现象可以看出,第三次增殖的愈伤组织从原来的细胞分裂局限在组织外缘转向了愈伤组织内部深处的局部地区,细胞的分裂出现了瘤状结构外表和内部分化。

三、结论

美国红枫种胚愈伤组织最适诱导培养基为1/2MS+6-BA2+IAA0.5;最适增殖培养基为1/2MS+6-BA2+NAA0.5。诱导和增殖培养基均添加1.5%葡萄糖、0.8%琼脂;从培养基成分来看,无机盐含量低有利于愈伤组织的诱导。对美国红枫离体芽分化和生根试验有待于进一步研究。